(продолжение,

начало см. в №207-208)

Так за что же так упорно боролись отцы и деды современного поколения отечественных исследователей-биологов? Оценить это можно и по частной истории развития биологической науки в ПИЯФ. В отсутствие безгрешных объективных и всеобщих критериев оценки уровня научных исследований, можно обратиться к выработанной в ПИЯФ конкурсной практике ежегодного определения лучших работ института. Жесткие требования к представляемым на конкурс работам, заложенные в уставе Конкурсной комиссии со стадией тщательного их предварительного рассмотрения на семинарах и проблемных Ученых советах института, с последующим всесторонним анализом места представляемых работ относительно достижений мировой и отечественной науки, делают итоги работы комиссии действительно апофеозом годовых трудовых усилий ученых института. За сорокалетнюю историю Конкурса учёные ОМРБ 9 раз становились лауреатами в разряде «Лучших работ ПИЯФ» (даты выхода этих работ в тексте выделены жирным шрифтом) и 39 раз удостаивались первых премий. Хронология наиболее значимых достижений ОМРБ открывается работой В. Н. Фомичёва «Создание ЭПР-спектрометра», (1967 г.). Автору в своё время Бреслером была поставлена задача повышения концентрационной чувствительности ЭПР-спектрометров, которая могла бы обеспечить возможность исследования структур биологических макромолекул в водных растворах, чему в спектрометрах того времени препятствовали большие потери СВЧ-мощности при прохождении её через полярную водную среду. Эта задача была решена с помощью разработанных балансных резонаторов на основе гиротропных эффектов вместо обычной регистрации коэффициента отражения или прохождения СВЧ-мощности через резонатор ЭПР-спектрометра. Это открыло путь к увеличению чувствительности метода ЭПР-спектроскопии за счет резкого увеличения мощности СВЧ-генератора. Если обычные системы баланса позволяли работать с источниками мощностью 1-10 мВт, то балансные резонаторы за счет глубокого частотно-независимого баланса могли работать с СВЧ-генераторами мощностью 1-10 Вт. Созданный на основе этих резонаторов модуляционный ЭПР-спектрометр прямого детектирования обеспечивал концентрационную чувствительность при работе с водными растворами более чем на два порядка превышающей чувствительность существующих спектрометров. Дальнейшие исследования показали, что с помощью балансных резонаторов на основе гиротропных эффектов можно разрешить внутреннее противоречие между чувствительностью и точностью регистрации формы линий в спектрах ЭПР, существовавшее в модуляционных ЭПР-спектрометрах, и, как оказалось, делать это можно радикальным способом, отказавшись от модуляции магнитного поля. Эта находка позволила к 1981 г. коллективу разработчиков ОМРБ установить принципы метода регистрации и создать безмодуляционный ЭПР-спектрометр 3-сантиметрового диапазона длин волн. Используя эти преимущества безмодуляционного способа регистрации спектров ЭПР в экспериментах со спин-меченой тРНК^фен было показано, что тРНК^фен в растворе всегда находится в смеси конформеров независимо от ее биологического состояния и условий среды.

 В 1974 г. В. Н. Фомичёвым, В. В. Исаевым-Ивановым и В. А. Рыжовым были теоретически предсказаны и экспериментально обнаружены нелинейные эффекты в магнетиках в параллельных магнитных полях. Разработанная теория этих эффектов предсказывала для систем с короткими временами релаксации весьма высокую чувствительность нового метода. Выяснение природы обнаруженных эффектов показало, что к нелинейным откликам системы приводят «запрещённые» переходы в параллельных полях. Позже была выяснена природа и паразитного сигнала, сильно ограничивавшего реальную чувствительность установки, что позволило приблизиться к уровню, близкому к теоретической чувствительности. В настоящее время созданная установка с успехом используется, в частности, для исследования высокотемпературной сверхпроводимости купратов и манганитов. Для утверждения нового метода исследования магнитных свойств веществ от авторов потребовалось проведение обстоятельных обсуждений на Московском физическом семинаре В. Л. Гинзбурга и в Казанском физико-техническом институте, и только после их одобрения первая статья  по нелинейным эффектам была принята к опубликованию в ЖЭТФ.

Фейерверк работ по механизмам биосинтеза белка, выполненных командами С. В. Кириллова и Е. М. Саминского (отмечены премиями ПИЯФ 1970, 1976, 1979, 1983, 1985, 1992, 1993, 2003, 2006), покоится прежде всего на их изящных методических достижениях, позволивших впервые в мире разработать технологию получения прокариотических 70S рибосом, проявляющих 100%-ную активность во всех парциальных реакциях цикла элонгации (т.е. удлинения синтезируемой в рибосоме белковой цепи на одну аминокислоту), которые включают в себя связывание аминоацил-тРНК с А сайтом, далее, синтез пептидной связи и, наконец, транслокацию пептидил-тРНК из А в Р сайт. Экспериментальные исследования с такими высокоактивными рибосомами позволили впервые обнаружить, что их 30S субчастицы содержат не один, а два сайта для связывания тРНК. Далее было установлено, что 70S рибосома, помимо двух канонических А и Р сайтов, содержит третий, Е (выходной) сайт, специфично занимаемый только деацилированной тРНК, и локализован он в основном на 50S субчастице рибосомы. Кроме того, удалось показать, что вновь синтезированная в А сайте пептидил-тРНК способна спонтанно занимать гибридное А/P сосотояние. Эти и ряд других полученных результатов носят фундаментальный характер, поскольку процесс элонгации синтезируемой белковой молекулы реализуется через последовательную цепь взаимодействий тРНК в различных функциональных состояниях (аминоацил-, пептидил- и деацилированной) с 30S и 50S субчастицами целостной 70S рибосомы.

Беседа проф. С.Е.Бреслера и лауреата Нобелевской премииФ.Крика на Дискуссиях Фарадеевского Общества (Англия, 1958г.)

 Необычайно тяжёлое для науки постперестроечное безвременье начала 90-х годов побудило Кириллова, гладиатора по натуре, на реализацию его давней идеи по организации широкого сотрудничества с ведущими лабораториями мира, работающими в области биосинтеза белка. В результате, Кирилловым и его сотрудниками был выполнен ряд совместных проектов с коллегами из университетов США, Дании, Италии и Германии с использованием современных методик (техники измерения быстрых реакций, применение флуоресцентномеченых и мутантных производных тРНК и т.д.). Идеи многих этих совместных работ были предложены нашими сотрудниками, принимавшими, впрочем, самое активное участие и в их экспериментальной проверке (Кириллов С. В., Семенков Ю. П., Катунин В. И., Коневега А. Л.).  Из полученных результатов упомянем лишь основные,  касающиеся наиболее сложного и многоступенчатого этапа цикла элонгации – транслокации: твёрдо установлено, что гидролиз GTP происходит не после, а до транслокации, т.е. энергия фосфоэфирной связи “запасенная” в молекуле GTP, используется для катализа транслокации, а не для удаления уже “отработавшего” фактора транслокации EF-G из рибосомы, как это было принято в классической модели. Далее, было показано, что конфигурация рибосомного комплекса с гибридными А/Р и Р/E положениями двух тРНК является одной из промежуточных стадий процесса транслокации и реализуется после прихода в рибосому комплекса EF-G·GTP, а не до, на чем уже почти 20 лет настаивают американские исследователи группы H.Noller’a. И, наконец, была обнаружена обратимость процесса транслокации. Последний результат свидетельствует в пользу диффузионной модели транслокации, которая была предложена С.Е.Бреслером еще в 1975 г. на Советско-Американском симпозиуме по нуклеиновым кислотам (г.Киев).

 На этом сложном перекрёстке механизмов биосинтеза белка лежат ключи к решению насущных задач практического здравоохранения. Так например, поскольку генетическая информация ряда патогенных РНК-содержащих вирусов (ВИЧ, гепатит С и др.) реализуется трансляцией этих РНК на рибосомах клетки-хозяина, то полное их “прочтение”, ведущее к синтезу всех закодированных в них белков и, в конечном счете, к размножению вируса в клетке, возможно только в том случае, если на определенном этапе трансляции происходит сдвиг рамки считывания РНК на одно звено в обратном направлении (-1СРС). Масштабное исследование механизма (-1СРС), проводимое в настоящее время группой В.И.Катунина лаборатории биосинтеза белка, позволит приблизиться к адресному поиску эффективных антивирусных агентов.

    C момента зарождения молекулярной биологии стало ясно, что ей предстоит исследовать молекулярные механизмы рекомбинации, репарации и репликации ДНК (так называемую проблему Трех “Р”). Эти три генетических механизма ответственны за целостность, воспроизводимость и в то же время изменчивость генома как любой клетки, от бактерий до человека. Все три Р тесно взаимосвязаны, так как рекомбинация является частью репарационных процессов в клетке (рекомбинационная репарация), а правильная репликация не обходится без рекомбинационной репарации.

 Лаборатория молекулярной генетики (зав. лаб. В.А.Ланцов) успешно продолжила изучение молекулярных механизмов гомологической рекомбинации, начатое по инициативе С.Е Бреслера. В ту пору им удалось вычленить в бактериальной рекомбинации два переплетающихся процесса. Действительно, когда взаимодействуют две двунитевые молекулы ДНК, то рекомбинация между ними проходит путем двунитевого обмена, но, как правило, она может сопровождаться также и обменами однонитевыми фрагментами. Авторам удалось в специально сконструированной системе вычленить оба механизма одно- и двунитевого обмена и показать их различия по количественным генетическим параметрам (1982 г.).

В гомологической рекомбинации оказался один главный белок (RecA), который участвует практически на всех этапах рекомбинационной реакции обмена нитями ДНК. Как выяснилось, RecA- подобные белки представлены повсеместно во всех царствах живого, что и предопределяет сходство молекулярных основ гомологической рекомбинации от бактерии до человека. Лаборатория Ланцова приняла самое деятельное участие в доказательствах этого (1998.г.), и эта работа продолжается и по настоящее время. Правда центр исследований лаборатория перенесла на структурно-функциональный анализ представителей семейства главных рекомбиназ в различных царствах живого, что стало возможным благодаря комплексному использованию генетических и биохимических подходов с новыми физико-химическими подходами и методами компьютерного моделирования, развиваемыми в лаборатории В.В. Исаева-Иванова (1999 г.). В последние годы лаборатория изучает гиперхарактеристики RecA-подобных рекомбиназ, такие как гиперрекомбинационная активность и гипертермостабильность. В совместных работах с М. Г. Петуховым (2000 г.) показано, что термоустойчивость бактериального белка RecA сопряжена с большей суммарной стабильностью его a-спиралей. Выявлены принципы эволюционного отбора белков RecA из психротрофных, мезофильных и термофильных бактерий. Эти принципы могут лежать в основе отбора любого универсального (т.е. представленного во всех видах живой материи) белка.

 К этим же “крайним” гиперпроцессам относится и гиперрадиорезистентность, молекулярные механизмы которой на протяжении многих лет исследует группа индуцибельных систем клетки (созданная В. Л. Калининым и руководимая в настоящее время В.Н. Вербенко) на оригинальной модельной системе мутантов Еscherichia coli, устойчивость которых к гамма-облучению была искусственно поднята в 8 раз по сравнению с обычными клетками (1987 г.). Оказалось, что достижение этой гиперфункции обеспечивается за счёт активации не только классических систем репарации, таких как SOS-репарация и рекомбинационная репарация двунитевых разрывов ДНК, но и ряда глобальных стрессовых систем клетки, включая белки системы теплового шока, обеспечивающие  как деградацию, так и ренатурацию поврежденных белков, а также белки системы холодового шока (шок – это стрессовая ситуация, возникающая в клетке после резкого изменения внешних условий, что, как правило, сопряжено с повышенной экспрессией белков системы шока).

 В. Л. Калинин являлся одним из ветеранов чтения спецкурсов студентам старших курсов кафедры биофизики ЛПИ. В последние годы его интересные лекции «Транскрипция и регуляция экспрессии генов», «Введение в молекулярную вирусологию», «Основы репликации» (2004 г.) были изданы издательско-полиграфическим отделом ПИЯФ и сегодня пользуются большой популярностью у студентов-биофизиков. Будучи по своей душевной конструкции художником и находясь долгие годы под впечатлением лекторского мастерства Бреслера, Калинин и сам научился создавать из своих лекций драматические шедевры, что нашло отражение  в изданной монографии.

 В лаборатории генетики эукариот (1968, 1973, 1976, 1979, 1993, 2005 гг.) в 1967 г. одновременно с несколькими зарубежными лабораториями были описаны радиочувствительные мутанты дрожжей, оказавшиеся ценным материалом для изучения процессов репарации и мутагенеза, а в 1973 г. также впервые были получены радиочувствительные мутанты многоклеточного организма – дрозофилы, дальнейшее изучение которых дало интересные сведения о механизмах радиочувствительности высших, эукариотических, организмов.

 Три года спустя И. А. Захаров с соавторами открыл особое явление, названное цитодукцией, состоящее в половом слиянии клеток, при котором смешиваются структуры цитоплазмы, но слияния ядер не происходит. В результате зигота приобретает наследственные признаки, которые кодируются исключительно цитоплазматическими генетическими факторами, в частности митохондриями. В настоящее время это явление широко используется при изучении цитоплазматических наследственных факторов.

 Ещё раньше, в 1968 г. в лаборатории было обнаружено, что у некоторых радиочувствительных мутантов (с дефектами репарации) дрожжей повышена частота спонтанного мутационного процесса. Это означает, что система репарации участвует в исправлении естественно возникающих повреждений в генетическом аппарате, то есть контролирует его стабильность. Впервые этот эффект был продемонстрирован для эукариот, что затем подтвердилось другими авторами. В 1973 г. впервые было показано, что при облучении клеток мутантов дрожжей с нарушенной репарацией может изменяться спектр возникающих мутаций, свидетельствуя о том, что система репарации определяет не только частоту, но и природу генных мутаций.

 В 80-х годах С. А. Булат установил, что интеграция плазмид в дрожжевые хромосомы сопровождается двумя процессами – дестабилизацией хромосом, в которые интегрируется плазмида и захватом соседних генов при освобождении плазмиды (последнее названо седукцией гена). Этот эффект дестабилизации хромосом послужил базой для разработки метода генетического картирования, который позволил ускорить процесс картирования новых генов в десятки раз.

 В начале 70-х годов В. Г. Королёвым и Л. М. Грачёвой было впервые установлено, что клетки дрожжей способны к реапарации двунитевых разрывов ДНК, которые до этого считались абсолютно летальными повреждениями генетического материала клетки. Авторы описали молекулярный механизм этого процесса. Только через четыре года зарубежные исследователи опубликовали аналогичный механизм репарации двунитевых разрывов ДНК со ссылкой на работу, выполненную в ОМРБ. Эти важнейшие наблюдения послужили фундаментом для разработки особой ветви репарационного процесса - рекомбинационной репарации.

 Главные достижения лаборатории биосинтеза ДНК (зав. В. М. Крутяков, 1975, 1996 гг) состоят в следующем: впервые было установлено, что гамма-облучение хроматина (вещества хромосом, в котором упакована ДНК) грызунов и человека приводит к активации репаративного синтеза ДНК на порядок величины. Это происходит вследствие ослабления связей облучённой ДНК со щелочными белками-гистонами, что приводит к деконденсации хроматина (50 – 70% эффекта) и вследствие действия репаративных нуклеаз. Репаративные ферменты спасают клетку при малой степени повреждения ДНК, но при нарастании количества повреждений нуклеазы убивают клетку вследствие ферментативной деградации генома, уже не уравновешенной синтезом ДНК. При этом радиопротекторы, напоминающие по структуре гистоны, уменьшают деградацию генома, конденсируя хроматин.

 Впервые были выделены 3¢®5¢-экзонуклеазы, выщепляющие нуклеотиды, неправильно присоединённые к 3¢-концам ДНК, а также комплексы этих ферментов с ДНК-полимеразами альфа, бета и дельта. 3¢®5¢-Экзонуклеазы выщепляют нуклеотиды в направлении, обратном синтезу ДНК, т.е. “редактируют” ошибки репликации ДНК. Эти корректорские экзонуклеазы в клеточной концентрации увеличивают на 1-2 порядка точность работы указанных трёх ДНК-полимераз и ДНК-полимеразы I. Данные ферменты распространены среди организмов по всему филогенетическому древу. 

 Отмеченные достижения лаборатории весьма важны для понимания мутагенеза и канцерогенеза. Ошибки биосинтеза ДНК являются предмутационными повреждениями. Мутации же рассматриваются как одна из основных причин канцерогенеза и новых наследственных болезней. Предраковая клетка является мутатором (т.е. характеризуется повышенной частотой спонтанного мутагенеза), в котором среди тысяч различных мутаций могут возникнуть 5-7 мутаций в онкогенах, превращающих клетку в раковую. Если удастся через внутриклеточную суперпродукцию корректорских экзонуклеаз получить клетки-антимутаторы у млекопитающих, то появится возможность с помощью генной инженерии вырастить животное с повышенной точностью биосинтеза ДНК в каждой клетке.

 В группе Д. А. Перумова (лаб. биополимеров) после открытия сверхсинтеза рибофлавина в клетках бактерий Bacillus subtilles было предпринято исследование механизма флавиногенеза, что, в конечном счёте, послужило основой для разработки семейства штаммов-продуцентов рибофлавина (1997 г.). В настоящее время эти штаммы используются в промышленном производстве рибофлавина как на постсоветском пространстве, так и за его пределами (Китай), что подтверждено двумя международными патентами.

 В другой интересной работе этой группы (2002 г.) было показано, что в ходе синтеза бактериальными клетками ряда витаминов, нуклеотидов и аминокислот регуляция транскрипции на уровне мРНК осуществляется без участия генов-регуляторов, а происходит путём непосредственного взаимодействия этих низкомолекулярных соединений с лидерными транскриптами, т.е. по сути дела, был предложен новый механизм транскрипции у бактерий.

 Из работ группы М. И. Мосевицкого следует отметить открытие в 1970-х годах явления "сплошного мутагенеза" у бактерий при дефиците одного из предшественников синтеза ДНК (тимидиловой кислоты), которое было опубликовано в Nature и Mutation Res. Примерно к этому же времени относится прямое наблюдение рекомбинантных хромосом в электронном микроскопе (публикации в Мол. Биол., BBA и J. Molec. Biol.). Из текущих исследований  следует отметить открытие белка нервных окончаний человека BASP1 и обнаружение его олигомерных форм (наноструктур), опубликованное в Биохимии, Biochimie и J. Neurochem.

Ведущий научный сотрудник ОМРБ ПИЯФ РАН

Г.А. Багиян

(Продолжение следует)