 |
||||
К
100-летию со дня рождения Учителя: профессора Семена Ефимовича Бреслера |
||||
В
этом сообщении я хочу подвести итоги работ по изучению механизма биосинтеза
белка, инициированных профессором
С.Е.Бреслером в В Переход Бреслера С.Е. на изучение биологических объектов не был случайным. Изучение структуры белков и их каталитических свойств было уже много лет до этого в сфере его научных интересов. Так, в 1945г., когда еще не было известно, что белки - это индивидуальные молекулы со строго определенной последовательностью аминокислотных остатков в полипептидных цепях, а не сополимеры аминокислот, Бреслером С.Е. совместно с Талмудом Д.Л. были сформулированы основные принципы молекулярной организации глобулярных белков. Эти принципы в течение 40 лет служили основными постулатами для предсказания пространственной структуры белков по первичной структуре – последовательности аминокислотных остатков в их полипептидных цепях.
Закономерен и интерес Учителя к механизму биосинтеза белка в рибосомах, центральному процессу по реализации генетической информации в клетке от ДНК к РНК, от РНК к белку. Так, мой аспирантский план уже тогда был сформулирован им как изучение кинетики синтеза белка в клетке. Несмотря на то, что к реализации этого плана на молекулярном уровне по существу мы подошли только через 40 лет, выбранное направление оказалось очень плодотворным. Об этом я и хочу рассказать сегодня и показать, что мы не подвели своего Учителя и занимаем достойное место в мировой рибосомологии. Синтез белка происходит в рибонуклеопротеиновых частицах – рибосомах - универсальных фабриках, соединяющих аминокислотные остатки в полипептидные цепи белков по заданной программе. Эта программа передается по наследству в виде последовательности нуклеотидов ДНК, содержащих четыре типа оснований (А,Т,Г,Ц). Комбинация из трех нуклеотидов кодирует очередную аминокислоту (всего 20 разных аминокислот). Для реализации этой программы сначала по ДНК синтезируется информационная (матричная) РНК (мРНК), несущая ту же информацию в последовательности ее нуклеотидов. Затем она связывается с рибосомами, где с участием небольших по размеру транспортных РНК (тРНК) происходит перевод информации из последовательности нуклеотидов в последовательность аминокислот. Транспортные РНК имеют в своей структуре тройку нуклеотидов (антикодон), узнающую один из триплетов (кодонов) мРНК в рибосоме, и, в то же время, эта тРНК связывает с помощью специфического белка определенную аминокислоту, закодированную этим кодоном мРНК. Таким образом, тРНК с присоединенной аминокислотой (аминоацил-тРНК), связываясь с рибосомой, выполняет функцию переводчика информации из последовательности нуклеотидов в последовательность аминокислот и поставляет очередную аминокислоту в А (аминоацильный)-сайт синтезирующего центра рибосомы (пептидил-трансферазный центр – ПТЦ), где рибосома катализирует реакцию образования пептидной связи между этой аминокислотой и пептидил-тРНК (растущим пептидом, связанным с предыдущей тРНК в Р (пептидильном) сайте рибосомы). Затем, с участием специального белка происходит транслокация – передвижение матрицы на один триплет с одновременным движением удлиненной пептидил-тРНК из А в Р-сайт и деацилированной тРНК из Р в Е-сайт (выходной – Exit) рибосомы. На А-сайте теперь оказывается очередной триплет, кодирующий следующую аминокислоту, и весь цикл может повториться. Начало синтеза белковой молекулы определяет инициаторный кодон в мРНК, кодирующий инициаторную формилметионил-тРНК при участии нескольких белковых факторов инициирования. Для окончания синтеза служит нонсенс кодон в матричной РНК, не кодирующий никакой аминоацил-тРНК при участии нескольких терминаторных белковых факторов. Такова схема синтеза белка в рибосоме при сильном упрощении. Рибосома бактерий 70S
– чрезвычайно сложное образование с молекулярным весом 2,5 миллиона
дальтон, состоящее из двух частей.
Первое десятилетие 21 века ознаменовалось выдающимся достижением в молекулярной
биологии – получением пространственных структур как целой 70S рибосомы, так и отдельных субчастиц рибосом
и их нескольких функциональных комплексов. Сотни тысяч атомов этих сложнейших
структур были расставлены в пространстве с точностью 2,5-3,5 ангстрем.
Методом рентгенографии выполнена задача несравнимо более сложная, чем
установление ранее пространственных структур даже самых больших
белков. Эта фантастически сложная работа была оценена по достоинству,
и в 2009 году Нобелевскyю премию по химии «За исследования структуры и функции рибосомы»
получили трое ученых: Ада Йонат (Ada E. Главной задачей молекулярной биологии всегда было и есть: понять, как данная структура выполняет данную функцию. Мы никогда не занимались структурой рибосомы, только функциями, и справедливо спросить по истечении 50-летних исследований: сделали ли мы что-либо существенно - важное в этом направлении, и как мы и другие российские ученые смотримся на фоне Нобелевских лауреатов? Для оценки нашего вклада в изучение функций рибосомы я приведу статистику цитирования из обзора В. Рамакришнана, опубликованного за 2 месяца до получения им Нобелевской премии: «Что недавно установленные структуры рибосомы дали для понимания механизма трансляции» (цитировано 134 работы) и его экспериментальной работы 2006г.: “Структура 70S рибосомы в комплексе с мРНК и тРНК” (цитировано 46 работ). Из 180 ссылок на важнейшие работы по связи структуры и функции
рибосомы на долю сотрудников Лаборатории Биосинтеза Белка (ЛББ) ОМРБ
выпало 9: Катунин В.И.- 3 работы, Кириллов С.В.-3,
Коневега А.Л.- 2, Семенков Ю.П.- 1.
Эти работы выполнены совместно с университетами США (Пенсильванским,
Йельским, Джефферсона, Массачусетским), Италии (Университетом Камерино),
Германии (Университетом Виттен-Хердеке и Институтом Физической
биохимии имени Макса Планка), Испании (Национальным центром Биотехнологии
и Центром для Кооперативных Исследований по Биологическим Наукам) и опубликованы в журналах с
высоким импакт фактором (Nature, Proc.Natl.Acad.Sci.USA , RNA и др.). Много это или мало для небольшого (менее 10 сотрудников) коллектива? Совсем неплохо, если учесть, что только 4 работы остальных российских институтов и Университетов цитированы здесь по этой проблеме: 3 работы Института Белка РАН и 1 работа Института Молекулярной биологии РАН. И это при том, что изучение механизма синтеза белка и структуры рибосом было одним из главных направлений по биологии в нашей Академии наук и возглавлялось шестью (полностью или частично занимающимися рибосомами) Академиками и несколькими Членами-корреспондентами РАН. Из многих сотен коллективов в мире, работающих по проблеме, больше нас цитированы публикации только 3х групп. В изучение механизма биосинтеза белка и структуры рибосом вовлечено огромное количество людей, и опубликовано в результате более 40 000 статей. Основная масса ссылок Рамакришнаном приведена на наиболее важные работы последних 10-15 лет и, в основном, по бактериальным рибосомам, структура которых установлена. При этом нет ссылок на фундаментальные факты, которые составили основу современной схемы синтеза белка в рибосоме и которые уже общеприняты и не обсуждаются сегодня. Это в полной мере касается и наших более ранних работ. За эти годы мы опубликовали около сотни работ в высокорейтинговых международных журналах. В начале 60-тых годов рибосома была настоящим “черным ящиком”. Только к этому времени сложилась концепция информационной РНК, и был расшифрован первый кодон для фенилаланина. Была высказана гипотеза о существовании РНК, выполняющей роль адаптора - переводчика, которым оказалась тРНК, но это было еще не доказано, шла идентификация истинно рибосомных белков и временно связывающихся в процессе синтеза белковых факторов. В современной схеме синтеза белка в рибосоме фигурирует промежуточное соединение синтеза – пептидил-тРНК, связанная кодон-антикодоновым взаимдействием с мРНК на двух рибосомных сайтах. А (аминоацильном) – после образования очередной пептидной связи и Р (пептидильном) – после транслокации. Мы выделили и изучили свойства этого промежуточного соединения, синтезированного в натуральной бесклеточной системе из бактерий (1966г.), а в 1979г. первыми доказали, что кодон-антикодоновое взаимодействие имеет место на Р-сайте, чего в отличие от А-сайта нельзя было утверждать a priori. Это наш первый фундаментальный вклад в современную схему работы рибосомы. Сложнейший
процесс синтеза белка в рибосоме можно представить как ряд последовательных
взаимодействий тРНК в трех функциональных формах с рибосомными
функциональными центрами – сайтами и их передвижения между сайтами по
ходу синтеза. По предложению Бреслера С.Е. мы стали изучать термодинамику
этих взаимодействий. Саминским Е.М. с сотр. был разработан количественный
метод измерения констант связывания тРНК с рибосомами. При
попытке провести такие же измерения в более сложной системе мы столкнулись
с рядом трудностей: высокой гетерогенностью и нестабильностью рибосом
и других компонентов системы, которые явились результатом их повреждения
и инактивации при разрушении клеток и несовершенства методик выделения
и очистки компонентов. Мы детально изучили все этапы выделения рибосом,
начиная с условий выращивания клеток и их разрушения, и установили ряд
причин обратимой и необратимой инактивации рибосом, нашли условия сохранения ими биологической активности. Теперь мы понимаем,
что нестабильность рибосом напрямую связана с динамическим характером
работы рибосомных комплексов. В
результате, к Сегодня все схемы синтеза в рибосоме содержат выходной Е-сайт со свойствами, описанными нами. Мы показали также, что нововведения группы Ниерхауса К. в схемы синтеза белка, которые быстро заполонили учебники на некоторое время, были результатом экспериментальных ошибок и неправильной интерпретации результатов (Кириллов С.В., Семенков Ю.П., 1986, 1996). Выходной сайт Е теперь фигурирует во всех схемах синтеза, как само собой разумеющееся, и без упоминания первооткрывателей. Мы установили, что благодаря кодон-антикодоновому взаимодействию сродство деацилированной тРНК к Р-сайту на 2-4 порядка величины выше, чем к Е-сайту. Отсюда сделали вывод (Кириллов С.В., 1983г.), что переход деацилированной тРНК с высокоаффинного Р на низкоаффинный Е-сайт в процессе транслокации не может происходить без компенсации свободной энергии cвязывания за счет сопряженной реакции гидролиза ГТФ фактором элонгации. Это было позднее доказано экспериментально (Катунин В.И.,1997) в совместной работе с Винтермайером В. В исследовании термодинамики процесса синтеза белка у нас не было практически конкурентов. Наши таблицы констант связывания функциональных форм тРНК с рибосомами в различных ионных условиях используются при проведении экспериментов не только в наших, но и во многих зарубежных лабораториях. Количественное изучение процесса взаимодействия тРНК с рибосомой позволило нам существенно детализировать механизм действия 16 антибиотиков, ингибиторов синтеза белка, используемых в терапевтических целях, найти единственный антибиотик - пурпуромицин, блокирующий аминоацилирование – присоединение аминокислоты к тРНК, обнаружить конформеры тРНК, отличающиеся на 5 порядков величины по сродству к рибосоме. Мы открыли новое фундаментальное свойство тРНК – существование в растворе всегда в виде равновесной смеси по крайней мере двух конформеров, и показали, что это равновесие зависит не только от ионных условий, но и от функционального состояния тРНК. К числу наших ранних, существенно-важных, достижений
мы относим и изобретение нового способа препаративного разделения субчастиц
рибосом методом гидрофобной хроматографии (Махно
В.И.,1978). Он является дополнительным к единственному существовавшему
до этого методу – разделению путем ультрацентрифугирования в градиенте
плотности. Этот метод (он получил широкое распространение в последнее
время) обладает рядом преимуществ и не требует дорогостоящего оборудования.
В частности, метод был использован нобелевским лауреатом Рамакришнаном В. для очистки
рибосом при получении их кристаллов
для рентгеноструктурного анализа. В конце 80-х годов появилась возможность, благодаря развитию техники остановленного потока, исследовать кинетику быстрых процессов при синтезе белка, протекающих за десятые и даже сотые доли секунды. В нашей стране до сих пор нет ни одного такого прибора, поэтому мы начали сотрудничество с зарубежными группами, имеющими такое оборудование. Прежде всего, с Винтермайером В., одним из первых применивших эту технику для исследования рибосом, а затем с Барри Куперманом (США, Пенсильванский университет), изучавшим этим методом работу редуктаз. Умение конструировать активные рибосомные комплексы и выделять индивидуальные тРНК в препаративных количествах, необходимых для кинетических экспериментов, делало нас выгодными партнерами. Способствовало этому и то, что Марина Роднина, выполнившая две свои первые научные работы в нашей лаборатории и защитившая кандидатскую диссертацию под руководством Семенкова Ю.П., работая вместе с Винтермайером В., за эти годы стала немецким Академиком, а с 2009 года - директором Института Физической Биохимии им. Макса Планка (Геттинген). Молекулы тРНК, специфичные к разным аминокислотам, различаются по первичной структуре (последовательности нуклеотидов). Однако все молекулы разных тРНК сложены в пространстве строго консервативным образом в форме латинской буквы L (Нобелевскую премию по химии 1982г. за структуру тРНК получил Aaron Klug, Великобритания). Ранее мы показали, что только антикодоновый стержень и петля
тРНК принимают участие в стационарном взаимодействии с рибосомой (с
30S субчастицей) и -ССА-конец с ПТЦ (на 50S субчастице). Функция Т- и Д-петель тРНК, составляющих центральную
часть молекулы (угол L- образной молекулы)
до недавнего времени не была установлена, хотя строгая консервативность
структуры уже предполагает ее важную функциональную роль. Изучая
кинетику движения тРНК, мы доказали
участие центральной части ее L-образной структуры (Т- и Д- петель) в
обеспечении динамических взаимодействий с рибосомой (Кириллов
С.В.,2006г.). Мы установили, что любые замены нуклеотидов в первичной структуре тРНК, нарушающие взаимодействие Т- и Д-петель, приводят к замедлению процессов образования промежуточных состояний, ответственных за движение тРНК в рибосоме, как при транслокации, так и при связывании на А-сайт (узнавание матрицы). Молекула тРНК связана с рибосомой через посредство множества слабых контактов. Движение тРНК между функциональными сайтами состоит в смене одного за другим соответствующих контактов с этими сайтами. Кинетически мы наблюдали два промежуточных состояния при фактор-зависимой транслокации (Кириллов С.В. 2007г.). Исследование методом криоэлектронной микроскопии обратного хода транслокации без участия фактора и затрат энергии, которое происходит очень медленно, обнаружило уже до 50 короткоживущих промежуточных состояний (Коневега А.Л. 2010г.). Рибосома не только осуществляет точный и быстрый синтез белков, но и участвует в целом ряде регуляторных процессов в клетке, редактируя и перекодируя в отдельных случаях начальную информацию в мРНК. Так, например, сдвиг рамки считывания, начала считывания кодонов в мРНК, реализуемый в рибосоме, позволяет синтезировать два разных белка по одной и той же мРНК. Этот механизм используется ретровирусами (в том числе вирусом иммунодефицита человека) для синтеза в определенном соотношении двух своих белков. Детальное изучение таких событий, реализуемых в ходе динамических взаимодействий тРНК в рибосоме, должно привести к созданию нового класса лекарств, специфических ингибиторов вирусных инфекций. В этом направлении и работает Лаборатория Биосинтеза Белка в настоящее время. Ведущий научный сотрудник
д.б.н. профессор Кириллов
С.В. (статья дана в сокращении. Полный вариант здесь) |
