К 100-летию со дня рождения Учителя: профессора

Семена Ефимовича Бреслера

В этом сообщении я хочу подвести итоги работ по изучению механизма биосинтеза белка, инициированных профессором С.Е.Бреслером в 1961 г. (в его лаборатории Института Высокомолекулярных Соединений АН СССР, затем переведенной в ФТИ им. А.Ф. Иоффе и позднее в ПИЯФ РАН) и продолжающихся по сей день в ОМРБ ФГБУ ПИЯФ им. Б.П. Константинова.

В 1960 г. я защитил диплом на кафедре физики изотопов физико-механического факультета ЛПИ им. М.И.Калинина и был приглашен С.Е.Бреслером в аспирантуру для продолжения работы по измерению коэффициента диффузии макромолекул полиизопрена в каучук. Пока я сдавал экзамены в аспирантуру и потом несколько месяцев продолжал эту работу на кафедре, Семен Ефимович уехал в США по приглашению нобелевского лауреата Ф.Липмана читать лекции в Рокфеллеровском университете. На полученный за чтение лекций гонорар он за два месяца объехал в США практически все центры, где в это время интенсивно шло развитие нового направления в биологии - молекулярной биологии – науки о молекулярной структуре и организации живых клеток. По возаращении Бреслер С.Е. получил официальное разрешение сменить тематику лаборатории с изучения физико-химии полимеров на молекулярную биологию. В это время в стране еще господствовала лысенковщина, но уже предпринимались первые шаги по реабилитации генетики и преподаванию в университетах современной биологии. Были написаны и изданы первые учебники: “Введение в молекулярную биологию” – Бреслером С.Е. и “Генетика” – Лобашевым М.Е.

Переход Бреслера С.Е. на изучение биологических объектов не был случайным. Изучение структуры белков и их каталитических свойств было уже много лет до этого в сфере его научных интересов. Так, в 1947г., когда еще не было известно, что белки это индивидуальные молекулы со строго определенной последовательностью аминокислотных остатков в полипептидных цепях, а не сополимеры аминокислот, Бреслером С.Е. совместно с Талмудом Д.Л. были сформулированы основные принципы молекулярной организации глобулярных белков. Эти прингципы в течение 40 лет служили основными постулатами для предсказания пространственной структуры белков по первичной структуре – последовательности аминокислотных остатков в их полипептидных цепях.

Закономерен и интерес Учителя к механизму биосинтеза белка в рибосомах, центральному процессу по реализации генетической информации в клетке от ДНК к РНК, от РНК к белку. Так, мой аспирантский план уже тогда был сформулирован им как изучение кинетики синтеза белка в клетке. Несмотря на то, что к реализации этого плана на молекулярном уровне по существу мы подошли только через 40 лет, выбранное направление оказалось очень плодотворным. Об этом я и хочу рассказать сегодня и показать, что мы не подвели своего Учителя и занимаем достойное место в мировой рибосомологии.

Синтез белка происходит в рибонуклеопротеиновых частицах – рибосомах-- универсальных фабриках, соединяющих аминокислотные остатки в полипептидные цепи белков по заданной программе. Эта программа передается по наследству в виде последовательности нуклеотидов ДНК, содержащих четыре типа оснований (А,Т,Г,Ц). Комбинация из трех нуклеотидов кодирует очередную аминокислоту (всего 20 разных аминокислот). Для реализации этой программы сначала по ДНК синтезируется информационная (матричная) РНК (мРНК), несущая ту же информацию в последовательности ее нуклеотидов. Затем она связывается с рибосомами, где с участием небольших по размеру транспортных РНК (тРНК) происходит перевод информации из последовательности нуклеотидов в последовательность аминокислот. Транспортные РНК имеют в своей структуре тройку нуклеотидов (антикодон), узнающую один из триплетов (кодонов) мРНК в рибосоме, и, в то же время, эта тРНК связывает с помощью специфического белка определенную аминокислоту, закодированную этим кодоном мРНК. Таким образом, тРНК с присоединенной аминокислотой (аминоацил-тРНК), связываясь с рибосомой, выполняет функцию переводчика информации из последовательности нуклеотидов в последовательность аминокислот и поставляет очередную аминокислоту в А (аминоацильный) сайт синтезирующего центра рибосомы (пептидил-трансферазный центр –ПТЦ), где рибосома катализирует реакцию образования пептидной связи между этой аминокислотой и пептидил-тРНК (растущим пептидом, связанным с предыдущей тРНК в Р (пептидильном) сайте рибосомы). Затем, с участием специального белка происходит транслокация – передвижение матрицы на один триплет с одновременным движением удлиненной пептидил-тРНК из А в Р-сайт и деацилированной тРНК из Р в Е-сайт (выходной –Exit) рибосомы. На А-сайте теперь оказывается очередной триплет, кодирующий следующую аминокислоту, и весь цикл может повториться. Начало синтеза белковой молекулы определяет инициаторный кодон в мРНК, кодирующий инициаторную формилметионил-тРНК при участии нескольких белковых факторов инициирования. Для окончания синтеза служит нонсенс кодон в матричной РНК, не кодирующий никакой аминоацил-тРНК, при участии нескольких терминаторных белковых факторов. Такова схема синтеза белка в рибосоме при сильном упрощении.

Рибосома бактерий 70S чрезвычайно сложное образование с молекулярным весом 2,5 миллиона дальтон и состоит из двух субчастиц. Малая 30S субчастица содержит одну молекулу рибосомной РНК (16S, длиной 1542 нуклеотида) и 21 молекулу рибосомных белков (все разные). На малой субчастице находится мРНК связывающий центр, где реализуется кодон-антикодоновое взаимодействие аминоацил-тРНК с мРНК. Большая 50S субчастица содержит 2 молекулы рибосомных РНК (23S РНК, 2904 нуклеотида и 5S рРНК, 120 нуклеотидов) и 34 молекулы рибосомных белков. На ней расположен ПТЦ, с которым связываются 3’- концы аминоацил-тРНК и пептидил-тРНК, между которыми и происходит реакция образования пептидной связи.

Первое десятилетие 21 века ознаменовалось выдающимся достижением в молекулярной биологии – получением пространственных структур как целой 70S рибосомы , так и отдельных субчастиц рибосом и их нескольких функциональных комплексов. Сотни тысяч атомов этих сложнейших структур были расставлены в пространстве с точностью 2,5-3,5 ангстрем. Методом рентгенографии выполнена задача несравнимо более сложная, чем установление ранее пространственных структур даже самых больших белков.

Эта фантастически сложная работа была оценена по достоинству, и в 2009 году Нобелевскyю Премию по химии «За исследования структуры и функции рибосомы» получили трое ученых: Ада Йонат (Ada E. Yonath, Israel), Венки Рамакришнан (Venkatraman Ramakrishnan, Unated Kingdom) и Томаc Стейц (Thomas A. Steitz, USA). В выборе 3-х кандидатов решающую роль определило установление структуры рибосом бактерий с атомарным разрешением. И даже при этом один из полноправных кандидатов на премию Гарри Ноллер (Harry Noller, USA) из-за правила 3-х остался за бортом.

Главной задачей молекулярной биологии всегда было и есть: понять, как данная структура выполняет данную функцию. Мы никогда не занимались структурой рибосомы, только функциями, и справедливо спросить по истечении 50-летних исследований: сделали ли мы что-либо существенно важное в этом направлении, и как мы и другие Российские ученые смотримся на фоне Нобелевских лауреатов?

Для оценки нашего вклада в изучение функций рибосомы я приведу статистику цитирования из обзора В. Рамакришнана, опубликованного за 2 месяца до получения им Нобелевской премии: «Что недавно установленные структуры рибосомы дали для понимания механизма трансляции» (Цитировано 134 работы) (1) и его экспериментальной работы 2006г.: “Структура 70S рибосомы в комплексе с мРНК и тРНК” (цитировано 46 работ) (2).

1. TM Schmeing & V Ramakrishnan. What recent ribosome structures have revealed about the mechanism of translation. Nature 461:1234-1242(2009).

2. M Selmer, CM Dunham, FV Murphy, IV, A Weixlbaumer, S Petry, AC Kelley, JR Weir, V.Ramakrishnan. Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA. Science 313:1945-1942(2006).

Из 180 ссылок на важнейшие работы по связи структуры и функции рибосомы на долю сотрудниkов Лаборатории Биосинтеза Белка (ЛББ) ОМРБ выпало 9:

Катунин В.И. (зав. ЛББ в настоящее время) – 3:

3. Rodnina MV, Savelsberg A, Katunin VI & Wintermeyer W. Hydrolysis of GTP elongation factor G drives tRNA movement on the ribosome. Nature 385:37-41(1997).

4. Katunin VI, Muth GW, Strobel SA, Wintermeyer W & Rodnina MV . Important contribution to catalysis of peptide bond formation by a single ionizing group within the ribosome. Mol.Cell 10:339-346(2002).

5. Savelsberg A, Katunin VI, Mohr D, Peske F, Rodnina MV & Wintermeyer W. Elongation factor G-induced ribosome rearrangement preceeds tRNA-mRNA translocation. Mol Cell 11: 1517-1523(2003).

Кириллов С.В. ( зав. ЛББ в 1978-1998) – 3:

6. Kirillov SV, Wower Y, Hixson SS, & Zimmermann RA. Tranzit of tRNA through the Escherichia coli ribosome: cross-linking of the 3’ end of tRNA to ribosomal proteins at the P and E sites. FEBS Lett. 514:60- 66 (2002).

7. Grigoriadou C, Marzi S, Kirillov S, Gualerzi CO, & Cooperman BS. A quantitative kinetic scheme for 70S translation initiation complex formation. J.Mol.Biol. 373:562-572 (2007).

8. Pan D, Kirillov SV, Cooperman BS. Kinetically competent intermediates in the translocation step of protein synthesis. Mol Cell 25:519-529 (2007).

КоневегаА.Л. – 2.

9. Milon P, Konevega AL, Gualerzi CO & Rodnina MV. Kinetic checkpoint at a late step in translation initiation. Mol Cell 30; 712-720(2008).

10.Julian P, Konevega AL, Sheres SH, Lazaro M, Gil D, Wintermyer W, Rodnina MV & Valle M . Structure of ratcheted ribosomes with tRNA in hybrid states. PNAS(USA) 105:16924-16927(2008).

Cеменков Ю.П. (зав. ЛББ в 1998-2009) – 1:

11. Semenkov YP, Rodnina MV Wintermeyer W. The “allosteric three-site model” of elongation cannot be confirmed in the well-defined ribosome system from Escherichia coli. PNAS(USA) 93:12183-12188(1996).

Эти работы выполнены совместно с университетами США (Пенсильванским, Йельским, Джефферсона, Массачусетским), Италии (Университетом Камерино), Германии (Университетом Виттен-Хердеке и Институтом Биофизической химии имени Макса Планка), Испании (Национальным центром Биотехнологии и Центром для Кооперативных Исследований по Биологическим Наукам) и опубликованы в журналах с высоким индексом цитирования.

Много это или мало для небольшого (менее 10 сотрудников) коллектива? Совсем неплохо, если учесть, что только 4 работы остальных Российских институтов и Университетов цитированы здесь по этой проблеме: 3 работы Института Белка РАН и 1 работа Института Молекулярной биологии РАН. И это при том, что изучение механизма синтеза белка и структуры рибосом было одним из главных направлений по биологии в нашей Академии наук и возглавлялось шестью (полностью или частично занимающимися рибосомами) Академиками и несколькими Членами-корреспондентами РАН.

Из многих сотен коллективов в мире, работающих по проблеме, больше нас цитированы публикации только 3-х групп:

( Wintermеyer W + Rodnina MV, Germany), изучали в основном функции – 18,

Noller H, USA ( структура и функции) - 14,

Frank J , USA ( структура и функции) - 12,

Noller H и Frank J были реально обсуждаемыми претендентами на премию, так как внесли существенный вклад в изучение как структуры, так и функций рибосомы.

Работ самих Нобелевских лауреатов цитировано:

Ramakrishnan V (самоцитирование) - 9

Steitz T - 6

Yonath A - 2

В изучение механизма биосинтеза белка и структуры рибосом вовлечено огромное количество людей и опубликовано в результате более 40 000 статей. Основная масса ссылок Рамакришнаном приведена на наиболее важные работы последних 10-15 лет и, в основном, по бактериальным рибосомам, структура которых установлена. При этом нет ссылок на фундаментальные факты, которые составили основу современной схемы синтеза белка в рибосоме и которые уже общеприняты и не обсуждаются сегодня . Это в полной мере касается и наших более ранних работ.

За эти годы мы опубликовали около сотни работ в высоко-рейтинговых международных журналах. Я могу остановиться здесь только на наших самых существенных результатах, которые вошли в современные схемы, использованы другими исследователями и которыми мы можем гордиться независимо от их цитируемости.

В начале 60-х годов рибосома была настоящим “черным ящиком”. Только к этому времени сложилась концепция информационной РНК и был расшифрован первый кодон для фенилаланина. Была высказана гипотеза о существовании РНК, выпоняющей роль адаптора - переводчика, которым оказалась тРНК, но это было еще не доказано, шла идентификация истинно рибосомных белков и временно связывающихся в процессе синтеза белковых факторов. Мы не знали, что все рибосомные белки разные, какую роль они выполняют и какую рибосомные РНК, кто катализирует образование пептидной связи: были уверены что белок, а оказалось что рибосомная 23S РНК и т.д. На многие вопросы мы не можем ответить даже сегодня.

В современной схеме синтеза белка в рибосоме фигурирует промежуточное соединение синтеза – пептидил-тРНК, связанная кодон-антикодоновым взаимдействием с мРНК на двух рибосомных сайтах А (аминоацильном) – после образования очередной пептидной связи и Р (пептидильным) – после транслокации. Несмотря на то, что даже в самых первых моделях синтеза белка в рибосомах пептидил-РНК присутствовала, как гипотетическое промежуточное соединение синтеза, необходимо было доказать, что оно реально существует, выделить и изучить его свойства. Впервые это удалось сделать Вальтеру Гилберту ( будущему Нобелевскому лауреату по химии за 1980г.) в модельной системе синтеза полифенилаланина по синтетической мРНК –поли(У), а мы выделили и изучили свойства этого промежуточного соединения, синтезированного в натуральной бесклеточной системе из бактерий (1966г.), а в 1979 г. первыми доказали, что кодон-антикодоновое взаимодействие имеет место на Р-сайте, чего в отличие от А-сайта нельзя было утверждать a priori. Это наш первый фундаментальный вклад в современную схему работы рибосомы.

Сложнейший процесс ситеза белка в рибосоме можно представить как ряд последовательных взаимодействий тРНК в трех функциональных формах (аминоацил-тРНК, пептидил-тРНК и деацилированная тРНК) с рибосомными функциональными центрами – сайтами и их передвижения между сайтами по ходу синтеза. По предложению Бреслера С.Е. мы стали изучать термодинамику этих взаимодействий. Для этого использовали бесклеточную систему синтеза, состоящую из выделенных из клеток рибосом, рибосомных субчастиц, мРНК, тРНК и ряда необходимых белковых факторов. На первом этапе использовали упрощенную систему, состоящую только из тРНК и рибосом и/или субчастиц, в которой синтез не шел. Саминским Е.М. с сотр. был разработан количественный метод измерения констант связывания тРНК с рибосомами путем равновесной седиментации комплексов в ультрацентрифуге и было измерено базальное взаимодействие тРНК с рибосомами и субчастицами, независимое от матрицы и белковых факторов. При попытке провести такие же измерения в более сложной системе мы столкнулись с рядом трудностей: высокой гетерогенностью и нестабильностью рибосом и других компонентов системы, которые явились результатом их повреждения и инактивации при разрушении клеток и несовершенства методик выделения и очистки компонентов. Только 10-15% рибосом, выделенных по описанным в литературе методикам, были обычно способны связывать аминоацил-тРНК и синтезировать полипептиды in vitro. Мы детально изучили все этапы выделения рибосом, начиная с условий выращивания клеток и их разрушения, и установили ряд причин обратимой и необратимой инактивации рибосом, нашли условия сохранения ими биологической активности. Теперь мы понимаем, что нестабильность рибосом напрямую связана с динамическим характером работы рибосомных комплексов. В результате, к 1980 г. мы получили рибосомы, полностью активные в синтезе и способные связывать одновременно три молекулы тРНК, что привело к изменению классической двух-сайтовой схемы синтеза (господствующей 20 лет) на трех-сайтовую за счет введения третьего сайта для тРНК, выполняющего роль выходного, специфического для деацилированной тРНК и не имеющего кодон-антикодонового взаимодействия с мРНК (12,13).

12. Саминский ЕМ, Граевская РА, Иванов ЮВ. Рибосома 70S содержит дополнительный сайт для деацилированной тРНК, не совпадающий с А и Р сайтами. Материалы I Всесоюзного симпозиума ”Реализация наследственной информации”, август 1980г, г. Паланга. Тезисы докл. Стр.91.

13. Grajevskaja RA, Ivanov VV, Saminsky. 70S ribosomes of E.coli have an additional site for deacylated tRNA. Eur.J.Biochem 128:47-52(1982).

Сегодня все схемы синтеза в рибосоме содержат выходной Е-сайт со свойствами, описанными нами (12-16). Однако в течение 10 лет наличие третьего сайта в рибосоме не признавалось, игнорировалось подавляющим большинством рибосомологов, так как, во-первых, в их собственных лабораториях рибосомы были малоактивными и связывали одновременно не более одной молекулы тРНК. А во-вторых, имелись принципиальные различия в свойствах третьего сайта опубликованных нами и группой немецкого ученого Кнуда Ниерхауса, также опубликовавшей данные о наличии третьего сайта в рибосоме. В отличие от нас немецкая группа утверждала, что пептидил-тРНК сохраняет кодон-антикодоновое взаимодействие на Е-сайте. Этому было придано принципиальное значение, изменяющее весь ход событий при трансляции, и на этом основании были сформулированы две трех-сайтовые модели синтеза, альтернативные классической модели Уотсона (Негативная аллостерическая модель и альфа-эпсилон модель). В то же время только две лаборатории выступили с утверждениями и экспериментальными данными, опровергающими наличие третьего сайта и его участие в синтезе белка в рибосоме: лаборатория академика Спирина А.С., Институт Белка АН) и Винтермайера В. (Германия). Последний перешел в лагерь трехсайтовиков после того, как мы объяснили ему, что его экспериментальные данные, как раз наоборот, подтверждают, а не опровергают наличие третьего сайта. В последующих работах его лаборатории была подтверждена независимость связывания тРНК на Е-сайт от мРНК и доказано, что Е-сайт действительно выполняет роль выходного. Окончательно Е-сайт был принят всеми после того, как мы измерили термодинамические параметры взаимодействия всех функциональных форм тРНК со всеми тремя сайтами в рибосоме и субчастицах и показали, что 30S субчастица дает основной вклад в энергию взаимодействия тРНК с А и Р сайтами рибосомы, а Е-сайт практически находится на 50S субчастице(14-16).

Мы показали также, что нововведения группы Ниерхауса К. в схемы синтеза белка, которые быстро заполонили учебники на некоторое время, были результатом экспериментальных ошибок и неправильной интерпретации результатов (11,17,18). Выходной сайт Е теперь фигурирует во всех схемах синтеза, как само собой разумеющееся и без упоминания первооткрывателей.

14. Kirillov SV, Makhno VI, Semenkov YuP. Mechanism of codon-anticodon interaction in ribosomes. Direct functional evidence that isolated 30S subunits contain two codon-cpecific sites for transfer RNA. NAR 8: 183-196(1980).

15.Kirillov CV, Makarov EM, ,& Semenkov YuP. Quantitative study of interaction of deacylated tRNA with E.coli ribosomes. Role of 50S subunits in formation of the E site. FEBS Lett.157:91-94(1983).

16. Парфенов ДВ, Саминский ЕМ. Дезацилированная тРНК

связывается с 50S субчастицей рибосом Е.coli на специальный участок, не совпадающий с участком Р’. Молекулярная биология 19:1378-1385(1984).

17.Kirillov SV & Semenkov YuP. Non-exlusion principle of AcPhe-tRNA interaction with the donor and acceptor sites of E.coli ribosomes. FEBS Lett. 148:235-238(1982).

18. Kirillov SV & Semenkov YuP. Extension of Watson’s model for the elongation cycle of protein biosynthesis. J.Biomol.Struct&Dyn. 4;263-269(1986).

Мы установили, что благодаря кодон-антикодоновому взаимодействию сродство деацилированной тРНК к Р-сайту на 2-4 порядка величины выше, чем к Е-сайту. Отсюда сделали вывод, что переход деацилированной тРНК с высокоаффинного Р на низкоаффинный Е-сайт в процессе транслокации не может происходить без компенсации свободной энергии cвязывания за счет сопряженной реакции гидролиза ГТФ фактором элонгации. Это было позднее доказано экспериментально в совместной работе с Винтермайером В. (3).

В исследовании термодинамики процесса синтеза белка у нас не было практически конкурентов. Наши таблицы констант связывания функциональных форм тРНК с рибосомами в различных ионных условиях используются при проведении экспериментов не только в наших, но и во многих зарубежных лабораториях.

Количественное изучение процесса взаимодействия тРНК с рибосомой позволило нам существенно детализировать механизм действия 16 антибиотиков, ингибиторов синтеза белка, используемых в терапевтических целях, найти единственный антибиотик - пурпуромицин, блокирующий аминоацилирование – присоединение аминокислоты к тРНК, обнаружить конформеры тРНК, отличающиеся на 5 порядков величины по сродству к рибосоме.

Мы открыли новое фундаментальное свойство тРНК (19) – существование в растворе всегда в виде равновесной смеси, по крайней мере, двух конформеров, и показали, что это равновесие зависит не только от ионных условий, но и от функционального состояния тРНК.

19. Bondarev GN, Isaev-Ivanov VV, Isaeva-Ivanova LS, Kirillov SV, Kleiner AR, Lepekhin AF, Odinzov VB, & Fomichev VN. Study on conformational states of E.coli tRNAPhe in solution by a modulation-free ESR-spectrometer. Nucl.Acids Res. 10:1113-1126 (1982).

Рентгеноструктурный анализ и криоэлектронная микроскопия рибосом показали теперь, что конформация тРНК в процессе синтеза изменена в переходных промежуточных состояниях по сравнению с таковой в стационарных сайтах и в кристалле. Это означает, что благодаря способности образовывать конформеры, конформационные изменения тРНК играют определяющую роль в механизме движения тРНК в рибосоме в процессе синтеза, так же как и конформационная подвижность самих рибосом (20).

20. Mittelstaet J, Konevega AL, Rodnina MV. Distortion of tRNA upon near-cognate codon recognition on the ribosome. J.Biol.Chem. 286:8158-8164(2011).

К числу наших ранних, существенно важных, достижений мы относим и изобретение нового способа препаративного разделения субчастиц рибосом методом гидрофобной хроматографии (21). Он является дополнительным к единственному существующему до этого методу – разделению путем ультрацентрифугирования в градиенте плотности. Новый метод обладает рядом преимуществ и не требует дорогостоющего оборудования. Метод был использован Рамакришнаном В. для изучения роли некоторых белков 30S субчастиц в процессе их самосборки и при очистке рибосом при получении их кристаллов для рентгеноструктурного анализа.

21. Kirillov SV, Makhno VI, Peshin NN, Semenkov YuP. Separation of ribosomal subunits of Escherichia coli ribosome by Sepharose chromatography using reverse salt gradient. NucleicAcids Res. 5:4305-4315(1978).

В конце 80-х годов появилась возможность, благодаря развитию техники остановленного потока, исследовать кинетику быстрых процессов при синтезе белка, протекающих за десятые и даже сотые доли секунды. В нашей стране до сих пор нет такой техники, поэтому мы начали сотрудничество с зарубежными группами, имеющими такие приборы. Прежде всего, с Винтермайером В., одним из первых применивших эту технику для исследования рибосом, а затем, с Барри Куперманом (США, Пенсильванский университет), изучавшим этим методом работу редуктаз. Умение конструировать активные рибосомные комплексы и выделять индивидуальные тРНК в препаративных количествах, необходимых для кинетических экспериментов, делало нас выгодными партнерами. Способствовало этому и то, что Марина Роднина, выполнившая две свои первые научные работы в нашей лаборатории и защитившая кандидатскую диссертацию под руководством Семенкова Ю.П., работая вместе с Винтермайером В., за эти годы стала немецким Академиком и с 2009 года директором Института Физической Биохимии им. Макса Планка (Геттинген).

Молекулы тРНК специфичные к разным аминокислотам различаются по первичной структуре (последовательности нуклеотидов). Однако все молекулы разных тРНК сложены в пространстве строго консервативным образом в форме латинской буквы L (Нобелевскую премию по химии 1982г. за структуру тРНК получил Aaron Klug, Великобритания).

Ранее мы показали, что только антикодоновый стержень и петля тРНК принимают участие в стационарном взаимодействии с рибосомой (с 30S субчастицей) и -ССА-конец с ПТЦ (на 50S субчастице) (22). Функция Т- и Д-петель тРНК, составляющих центральную часть молекулы (угол L- образной молекулы), до недавнего времени не была установлена, хотя строгая консервативность структуры уже предполагает ее важную функциональную роль.

22. Nekhai SA, Parfenov DV, Saminsky EM. tRNA regions which contact with the

Ribosomal poly(U)-programmed P site. BBA 1218:481-484(1994).

Изучая кинетику движения тРНК (измененных сайт-направленным мутагенезом), мы доказали участие центральной части ее L-образной структуры (Т- и Д- петель) в обеспечении динамических взаимодействий с рибосомой (8,23.24).

23. Pan D, Kirillov S, Zhang C-M, Hou Y-M & Cooperman BS. Rapid ribosomal translocation depends on the conserved 18-55 base pair in P-site transfer RNA. Nature Str.Mol.Biol. 13:354-359(2006).

24. Pan D, Zhang C-M, Kirillov S, Hou Y-M, Cooperman BS. Perturbation of the tRNA tertiary core differentially affects specific steps of the elongation cycle. J.Biol.Chem.283:18431-18440(2008).

Мы установили, что любые замены нуклеотидов в первичной структуре тРНК, нарушающие взаимодействие Т- и Д-петель, приводят к замедлению процессов образования промежуточных состояний, ответственных за движение тРНК в рибосоме, как при транслокации, так и при связывании на А сайт (узнавание матрицы). Молекула тРНК связана с рибосомой через посредство множества слабых контактов. Движение тРНК между функциональными сайтами состоит в смене одного за другим соответствующих контактов с этими сайтами. Кинетически мы наблюдали два промежуточных состояния при фактор-зависимой транслокации (8,23). Исследование методом криоэлектронной микроскопии обратного хода транслокации без участия фактора и затрат энергии (спонтанного), которое происходит очень медленно, обнаружило уже до 50 короткоживущих промежуточных состояний (24).

24. Fisher N, Konevega AL, Wintermeyer W, Rodnina MV, Stark H. Ribosome dynamics and tRNA movement by time-resolved electron cryomicroscopy. Nature, 466:329-333 (2010).

Рибосома не только осуществляет точный и быстрый синтез белков, но и участвует в целом ряде регуляторных процессов в клетке, редактируя и перекодируя в отдельных случаях начальную информацию в мРНК. Так например, сдвиг рамки считывания, начала считывания кодонов в мРНК, реализуемый в рибосоме, позволяет синтезировать два разных белка по одной и той же мРНК. Этот механизм используется ретровирусами (в том числе вирусом иммуннодефицита человека) для синтеза в определенном соотношении двух своих белков. Детальное изучение таких событий, реализуемых в ходе динамических взаимодействий тРНК в рибосоме, должно привести к созданию нового класса лекарств, специфических ингибиторов вирусных инфекций. В этом направлении и работает Лаборатория Биосинтеза Белка в настоящее время.

Ведущий научный сотрудник д.б.н.,

профессор Кириллов С.В.