С середины 60-х годов, в недавно организованном тогда РБО, начались работы по изучению биосинтеза белка, которые продолжаются в настоящее время в лаборатории биосинтеза белка (ЛББ) ОМРБ ПИЯФ. С тех пор наши знания о строении рибосомы, синтезирующей белки в клетке, от начальных сведений о составе (две субъединицы, состоящие из двух рибосомных нуклеиновых кислот и 50 рибосомных белков) продвинулись до установления рентгеноструктурным анализом пространственной структуры этого гигантского молекулярного комплекса, синтезирующего белки.

Для оценки вклада ЛББ в изучение функций рибосомы полезно привести статистику цитирования из обзора В. Рамакришнана, опубликованного за два месяца до получения им Нобелевской премии: «Что недавно установленные структуры рибосомы дали для понимания механизма трансляции» (Цитировано 134 работы) и его экспериментальной работы 2006 г: “Структура 70S рибосомы в комплексе с мРНК и тРНК” (цитировано 46 работ), соответственно.

Из 180 ссылок на важнейшие работы по связи структуры и функции рибосомы на долю сотрудников ЛББ ОМРБ приходится девять:

Катунин В.И. (зав. ЛББ до 2012 г.) – 3: NATURE 385:37-41(1997); Molecular Cell 10:339-346(2002); Molecular Cell 11: 1517-1523(2003).

Кириллов С.В. (зав. ЛББ в 1978-1998) – 3: FEBS Lett. 514:60- 66 (2002); J Mol Biol 373:562-572 (2007); Mol Cell 25:519-529 (2007).

Коневега А.Л. (зав. ЛББ в настоящее время) – 2: Mol Cell 30:712-720 (2008); Proc Natl Acad Sci (USA) 105:16924-16927(2008).

Cеменков Ю.П. (зав. ЛББ в 1998-2009) – 1: Proc Natl Acad Sci (USA) 93:12183-12188 (1996).

Эти работы выполнены в течение последних 15 лет совместно с университетами США (Пенсильванским, Йельским, Джефферсона, Массачусетским), Италии (Университетом Камерино), Германии (Университетом Виттен-Хердеке и Институтом Физической биохимии имени Макса Планка), Испании (Национальным центром Биотехнологии и Центром для Кооперативных Исследований по Биологическим Наукам). Девять цитирований совсем неплохо для небольшого коллектива, никогда не превышавшего 10 сотрудников, если учесть, что только 4 работы остальных Российских институтов цитированы здесь по этой популярной в нашей Академии Наук проблеме. Из нескольких сотен групп больше ЛББ в указанных двух работах цитированы публикации только 3-х коллективов: Wintermеyer W., Rodnina M.V. (Germany), (изучали в основном функции) – 18; Noller H, USA (структура и функции) - 14; Frank J., (USA, структура и функции) - 12, причем, Noller H. и Frank J. были реально обсуждаемыми претендентами на Нобелевскую премию, так как внесли существенный вклад в изучение как структуры, так и функций рибосомы.

Из сотни опубликованных ЛББ работ остановимся только на самых существенных результатах, которые общеприняты, вошли в современные схемы или использованы другими исследователями, и которыми можно гордиться независимо от их цитируемости.

Первый вклад ЛББ в современную схему биосинтеза белка состоял в выделении пептидил-тРНК из натуральной бесклеточной системы и в доказательстве сохранения кодон-антикодонового взаимодействия у пептидил-тРНК на Р сайте рибосомы.

Авторы первыми доказали существование гипотетического, прежде промежуточного, соединения биосинтеза белка - пептидил-тРНК при синтезе пептидов в натуральной бесклеточной системе из бактерий и изучили сравнительную стабильность пептидил-тРНК и аминоацил-тРНК.

Предложенная в 1964 году Дж. Уотсоном схема элонгации (наращивания) полипептидной цепи белка в рибосоме содержала два сайта для связывания тРНК: А сайт (для связывания очередной аминоацил-тРНК в соответствии с кодоном информационной РНК) и Р сайт (удерживающий пептидил-тРНК), и содержала концепцию транслокации – передвижения удлиненной после образования очередной пептидной связи на один аминокислотный остаток пептидил-тРНК из А в Р сайт с одновременным перемещением на один триплет информационной РНК и вытеснением деацилированной тРНК в раствор. В то время схема была гипотетическая, и лишь ряд косвенных данных свидетельствовал, что пептидил-тРНК является промежуточным соединением синтеза белка, но прямых данных о существовании такого промежуточного соединения не было, пока в 1980 году В. Гилберт (будущий лауреат Нобелевской премии по химии 1980г.), первым не показал образование синтетической полифенилаланил-тРНК в бесклеточной системе, а в ЛББ доказали существование такого промежуточного продукта при синтезе белка в натуральной бесклеточной системе из бактерий.

Далее отметим разработку методов выделения функционально активных рибосом и систематическое количественное изучение термодинамики взаимодействия тРНК с рибосомами, приведшее в конечном счете к введению третьего (выходного) сайта Е в современную схему работы рибосомы со свойствами, принятыми большинством исследователей сегодня: матрично-независимого, т.е. не имеющего кодон-антикодонового взаимодействия, специфического к деацилированной тРНК и расположенного на 50S субчастице, с высокой константой связывания, но быстро обмениваемого с деацилированной тРНК в растворе. Доказано, что EF-G-зависимый гидролиз ГТФ необходим для транслокации. По реакции с антибиотиком пуромицином обнаружены гибридные состояния тРНК в рибосоме и оценена их роль в транслокации.

Исследован механизм пептидилтрансферазной реакции; изучены механизмы действия 16 антибиотиков – ингибиторов различных стадий синтеза белка в рибосомах.

Показано, что транспортные РНК существуют в растворе в виде равновесной смеси двух конформеров, равновесие которых зависит от их функционального состояния. Сегодня конформеры тРНК наблюдают во всех промежуточных состояниях при движении тРНК между сайтами в рибосоме в процессе синтеза белка.

Установленная молекулярная структура рибосомы и некоторых функциональных комплексов дала толчок к количественному изучению процесса синтеза белка и роли рибосомы в регуляции жизнедеятельности клетки, но не привела пока к решению основных проблем: механизма усиления точности трансляции рибосомой, механизма движения тРНК, механизма сдвига рамки считывания.

Одним из главных направлений лаборатории биосинтеза белка сегодня остается изучение процесса транслокации, при которой осуществляется сдвиг рамки считывания. РНКовые вирусы заставляют пораженную ими клетку синтезировать два своих разных белка по одной и той же молекуле РНК, сдвигая в определенный момент на одну букву начало считывания в рибосоме нуклеотидной последовательности, кодирующей белки. Это происходит во время одного из этапов синтеза белка - транслокации, который сам состоит из нескольких стадий сложных макромолекулярных взаимодействий матричной и транспортных РНК и белкового фактора элонгации с рибосомными компонентами.

Знание молекулярных механизмов этих процессов должно неизбежно привести к созданию соединений, блокирующих эти процессы и, значит, эффективно тормозящих синтез только вирусных белков и, тем самым, блокирующих развитие вирусной инфекции. Над этой проблемой работают ученые ведущих лабораторий и крупнейшие фармацевтические фирмы мира. Создано множество теоретических моделей сдвига рамки считывания, зависящих от кинетических параметров связывания аминоацил-тРНК, образования пептидной связи и транслокации. Однако эти кинетические константы не были измерены ни в одной системе изучения сдвига рамки считывания in vitro. ЭТО ПРЕДСТОИТ ЕЩЕ СДЕЛАТЬ, и в этом направлении нами опубликованы первые две работы в 2014 году: (Cell 157:1619-1631, 2014; Nature Communications 5:4459, 2014).

д-р биолог. наук С.В.Кириллов

ОМРБ «ПИЯФ» НИЦ «КИ»