Посвящается памяти друга, автора выдающегося открытия

Три года назад, а именно 16 августа 2012 года ушел из жизни выдающийся ученый - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории Биополимеров ОМРБ Перумов Даниил Александрович.

Называя Перумова Д.А. выдающимся ученым, я нисколько не преувеличиваю, так как трудно переоценить значение для человечества сделанного им с коллегами и признанного в МИРЕ открытия РИБО-ПЕРЕКЛЮЧАТЕЛЕЙ (riboswitch), осуществляющих новый тип регуляции генов у бактерий.

Практически вся научная деятельность Данилы Перумова была посвящена изучению генетической регуляции оперона биосинтеза рибофлавина бактерий Bacillus subtilis c использованием химического мутагенеза in vitro на выделенной ДНК. Первоначальная цель была получить высокопроизводительный штамм этих бактерий для производства рибофлавина, для чего был расшифрован соответствующий участок генома. А конечным результатом этой работы явилось не только открытие нового типа регуляции метаболических генов, но и открытие рибо-переключателей. Последнее широко раздвинуло наши представления о функциональных возможностях РИБОНУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ. Оказалось, что рибо-переключатели принимают участие не только в регуляции экспрессии генов, но и множества других важнейших процессов в жизни клетки. Фактически появились новые области исследования с далеко идущими следствиями для современной биологии и медицины.

Основным условием существования любых живых организмов является наличие тонкой, гибкой, согласованно действующей системы регуляции, в которой все элементы тесно связаны друг с другом. В белковом синтезе не только количественный и качественный состав белков, но и время синтеза имеют большое значение. От этого зависит приспособление микроорганизмов к условиям окружающей питательной среды как биологической необходимости или приспособление сложного многоклеточного организма к физиологическим потребностям при изменении внутренних и внешних условий.

Клетки живых организмов обладают способностью синтезировать огромное количество разнообразных белков. Однако они никогда не синтезируют все белки одновременно. Количество и разнообразие синтезируемых белков, в частности ферментов, определяются степенью их участия в метаболизме. Синтез белка регулируется внешними и внутренними факторами и условиями, которые диктуют клетке синтез такого количества белка и такого набора белков, которые необходимы для выполнения физиологических функций. Все это свидетельствует о весьма сложном, тонком и целесообразном механизме регуляции синтеза белка в клетке.

В 1965 году трем французским ученым Львову А., Жакобу Ф. и Моно Ж. была присуждена Нобелевская премия «за открытия, связанные с генетическим контролем синтеза ферментов и вирусов». Сформулированная и доказанная ими так называемая негативная схема регуляции синтеза белка в бактериях реализуется на уровне транскрипции гена, т.е. синтеза по ДНК информационной, матричной РНК (мРНК), по которой в рибосомах синтезируется этот белок.

Существенно важную роль в этой схеме играют белки репрессоры, которые связываются с генами ненужных клетке в данный момент белков и запрещают синтез соответствующих мРНК. Долгое время считалось, что только белки могут связывать с высокой селективностью и высоким сродством низкомолекулярные метаболиты (продукт обмена веществ в живых клетках) и, благодаря этому, осуществлять запуск синтеза необходимых и остановку синтеза ненужных в данный момент клетке ферментов. В открытом новом типе регуляции активности генов низкомолекулярные промежуточные продукты или конечные метаболиты связываются с высоким сродством прямо с мРНК без участия белков.

В литературе открытие рибо-переключателей приурочивают к 2002 году и цитируют обычно две последние работы (4 и 5) в приведенном ниже списке.

Однако справедливее было бы отнести открытие к более раннему периоду и пяти работам в порядке публикации:

1. Бреслер СЕ, Глазунов ЕА, Черник ТП, Шевченко ТН, Перумов ДА. Исследование оперона биосинтеза рибофлавина у Bacillus subtilis. Сообщение V. Флавинмононуклеотид и флавинадениндинуклеотид как эффекторы рибофлавинового оперона. Генетика 9:84-91 (1973).

2. Миронов ВН, Перумов ДА, Краев АС, Степанов АИ, Скрябин КГ. Необычная структура регуляторной области оперона синтеза рибофлавина у Bacillus subtilis. Молекулярная биология 24:256-261 (1990).

3. Gelfand MS, Mironov AA, Jomantas J, Kozlov YI, Perumov DA. A conserved RNA structure element involved in the regulation of bacterial riboflavin synthesis genes. Trends Genet. 15:439-442 (1999).

4. Mironov AS, Gusarov I, Rafikov R, Lopez LE, Shatalin K, Kreneva RA, Perumov DA, Nudler E .”Sensing small molecules by nascent RNA: a mechanism to control transcription in bacteria”. Cell 111:747-56 (2002).

5. Winkler W, Navhi A, Dreaker RR. Thiamine derivatives вind messenger RNAs directly to regulate bacterial gene expression. Nature 419: 952-956 (2002).

Авторы первых трех публикаций - сотрудники ПИЯФ, Института Молекулярной Биологии им. В.А.Энгельгардта и Государственного Института Генетики и Селекции Промышленных Микроорганизмов. Четвертая работа выполнена в коллаборации с американскими авторами. Последняя работа опубликована другой группой - сотрудников Йельского Университета США.

Рибо-переключатель – это регуляторный сегмент молекулы мРНК, который, связывая небольшую молекулу метаболита, изменяет уровень синтеза белка, закодированного этой мРНК. Так мРНК, содержащая рибо-переключатель, прямым образом вовлечена в регуляцию своей собственной активности в зависимости от концентрации молекул своего эффектора – продукта, синтезируемого белком, который она кодирует. Рибо-переключатели способны репрессировать или активировать свои собственные гены на транскрипционном и трансляционном уровне.

Рибо-переключатель расположен в нетранслируемой части мРНК и состоит из двух частей; аптамера и так называемой экспрессионной платформы. Аптамеры – относительно небольшие искусственно созданные в 1990 г. нуклеиновые кислоты (минимальный найденный аптамер состоит из 34 нукдеотидов), обладающие специфической пространственной структурой, которая обеспечивает им высокую аффинность (сродство), порядка нескольких наномолей, к своему низкомолекулярному метаболиту, что сравнимо с аффинностью малых молекул к белкам.

Открытие рибо-переключателей у бактерий показало, что природа создала свои собственные аптамеры с еще более высокой специфичностью. При связывании своего метаболита аптамер изменяет свою сложную третичную структуру, что приводит к изменению второй части рибо-переключателя - экспрессионной платформы, которая в свою очередь изменяет (обычно выключает, но некоторые включают) трансляцию кодирующей последовательности мРНК, но может регулировать и транскрипцию этого гена и даже последующих.

Рибо-переключатели были открыты в бактериях как внутриклеточные сенсоры производных витаминов (рибофлавина и тиамина). Однако за последние 12 лет было найдено 20 классов рибо-переключателей, охватывающих широкий спектр малых метаболитов и ионов, включая коферменты, аминокислоты и нуклеотиды. И каждый год открывают несколько новых рибо-переключателей.

За последующие 13 лет с момента открытия биохимическими, структурными и генетическими исследованиями были установлены основные общие принципы функционирования рибо-переключателей, найденных во всех трех царствах жизни. Функции рибо-переключателей в живых организмах оказались значительно шире, чем просто новый широко распространенный тип контроля экспрессии генов. Приведу только несколько примеров:

а) Рибо-переключатели контролируют терминацию транскрипции.

б) Рибо-переключатель в мРНК транскрипте может регулировать транскрипцию следующего за ним гена и даже удаленного гена.

в) Рибо-переключатель ликвидирует последовательность в мРНК, ответственную за связывание с рибосомой, ингибируя (тормозя) таким образом трансляцию.

г) Рибо-переключатели могут регулировать экспрессию некодирующих РНК и контролировать доступность некоторых белков к нативной РНК (например, Rho фактора терминации и РНКазы Е).

д) Рибо-переключатель – рибозим, котрый сам себя расщепляет в присутствии достаточно высокой концентрации собственного метаболита.

е) Рибо-переключатель изменяет сплайсинг пре-мРНК.

Уже перечисленного достаточно, чтобы признать экстраординарную роль рибо-переключателей в изучении транскрипции, трансляции, сплайсинга, катализа, т.е. регуляции наиболее существенных процессов в живых организмах.

Если расшифровку генома человека и других организмов можно с полным правом считать главным достижением Науки 20-го века, то 21-е столетие будет несомненно посвящено изучению роли РНК в регуляции и реализации генетической информации.

Только 1.5 % генома человека кодирует структурные гены белков. Остальные 98.5 % ДНК (называемой ранее “мусорной”) кодирует малые, короткие и длинные, неструктурные РНК, регулирующие большинство событий в живой клетке. Именно они, так или иначе, определяют реализацию закодированной в ДНК информации: что, как, когда и в какой последовательности синтезируются и работают конечные продукты. Во многих типах некодирующих РНК именно рибо-переключатели обеспечивают регуляторные функции.

После установления пространственной структуры нескольких рибо-переключателей и обобщения этих данных оказалось, что типичный и наиболее универсальный по структуре и широко представленный рибо-переключатель - это TΨC- петля (Т- петля, Т-мотив), который был обраружен еще в 1974 году при установлении пространственной структуры фенилаланиновой тРНК из дрожжей. Последовательность TΨC присутствует во всех тРНК. Абсолютная консервативность этой последовательности уже предполагает ее очень важную биологическую функцию. В свободных транспортных РНК своеобразная конфигурация Т-петли стабилизирует L – образную форму молекул тРНК за счет ее взаимодействия с Д-петлей. Но только стабилизацией структуры дело не ограничивается. При взаимодействии тРНК с факторами элонгации и рибосомами в процессе синтеза белка, по-видимому, реализуются свойства Т-петли как рибо-переключателя: изменяется структура самой тРНК, и, следовательно, ее взаимодействие с рибосомами и факторами и обеспечивается движение тРНК в ходе процесса синтеза.

Сама деацилированная тРНК является эффектором рибо-переключателя Т-box, составленного из двух Т-петель. Накопление деацилированной тРНК при аминокислотном голодании приводит к ее связыванию с T-box, что обеспечивает строгий контроль сбалансированного синтеза рибосомных РНК и белков в клетке.

Более того, Т-мотивы были найдены в целом ряде некодирующих РНК, включая трансфер-мРНК, рибонуклеазу Р и целом ряде рибо-переключателей, регулирующих активность генов. Недавно найдены девять Т-петель в рибосомных 16S и 23S РНК термофилов и других бактерий.

Укладка длинных рибосомных РНК в компактную форму рибосомы обязана вторичным и третичным взаимодействиям нуклеотидов, обеспечивающих разные повороты (U-turn motifs, bulged G-motifs ), изломы (kink-turn motif) и другие необычные компактные конфигурации нуклеотидной цепи, обеспечивающие третичные взаимодействия удаленных областей РНК, которые дополнительно стабилизированны взаимодействиями с рибосомными белками. Между структурами всех этих мотивов есть много общего. Некоторые обеспечивают стабильность формы рибосомных субчастиц, а некоторые обеспечивают необходимые для выполнения функций динамические изменения структуры областей, вовлеченных во взаимодействия с факторами элонгации, инициирования и терминации, т.е. на всех этапах синтеза белка в рибосоме.

Весьма вероятно, что именно рибо-переключатели, например Т-мотивы, обнаруженные в структуре рибосомных РНК играют главную роль в реализации наблюдаемых значительных динамических макромолекулярных преобразований в ходе синтеза белка в рибосомах и представляют заманчивую НОВУЮ ЦЕЛЬ для создания НОВОГО КЛАССА антибиотиков, ингибиторов синтеза белка.

В последние годы уже ведется интенсивное производство искусственных рибо-переключателей как НОВОГО КЛАССА антибактериальных агентов, поскольку рибо-переключатели являются эффективным методом контроля экспрессии генома в организмах. Оказалось, что мишенью некоторых антибактериальных препаратов, открытых десятилетия назад, по, крайней мере, частично, являются рибо-переключатели. Установлено, например, что мишенью одного из известных антибиотиков пиритиамина является тиаминпирофосфат рибо-переключатель (TPP riboswitch).

Кроме того, применение искусственных рибо-переключателей является перспективным направлением и для исправления генетических недостатков у живых организмов.

Таким образом, открытие рибо-переключателей расширило наши знания о возможностях РНК. Рибо-переключатели продемонстрировали, что природные РНК могут связывать специфически маленькие молекулы, что считалось ранее прерогативой только белков и искусственно сконструированных аптамеров.

Наличие рибо-переключателей во всех царствах жизни доказывает гипотезу о возникновении жизни как МИРА РНК, в котором позже появились белки.

Действительно, РНК может делать все: кодировать, хранить и передавать по наследству генетическую информацию, регулировать ее экспрессию, переводить ее из нуклеотидного кода в аминокислотный, катализировать химические реакции от простых до самых сложноорганизованных, каким является синтез пептидной связи в рибосоме. Можно сказать, что в процессе эволюции РНК делегировала синтезированным ею белкам катализ простых химических реакций, поручила хранение и передачу по наследству большей части информации дезоксирибонуклеиновой кислоте ДНК, (дезоксирибонуклеотиды, из которых она состоит, синтезируются из рибонуклеотидов), сохранив за собой наиболее важные контрольные регуляторные функции основных процессов в живой клетке, не утратив в то же время и все делегированные белкам и ДНК способности.

Древний мир живого был чисто РНКовым, но сегодня можно сказать, что он таковым и остался, так как РНК в нем доминирует.

К глубочайшему сожалению преждевременная смерть прервала жизнь Даниила Александровича в расцвете его творческих сил.

Работы его не забыты, имеют высокий индекс цитирования, а сделанные им с сотрудниками открытия с каждым годом вовлекают в исследования новые обширные области молекулярной биологии и медицины.

Д-р биол. наук С.В. Кириллов